毕赤酵母表达重组植酸酶酶学性质的比较研究

通过酶学性质比较毕赤酵母GS115表达的E.coli K12植酸酶(appA)及其突变体植酸酶(appA NR)和黑曲霉植酸酶(phyA)的最适pH、温度、热稳定性及对胃蛋白酶和胰蛋白酶的耐受性.结果表明,在95℃,加热10 min,appA NR可残余90％左右的活力,而其他两种只残余20％～50％的活力;appAN...     

表达胰岛素的毕赤酵母生长动力学及诱导策略

对本实验室构建的一株重组巴斯德毕赤酵母基因工程菌的生长及诱导进行了研究,结果表明生长阶段菌体的生长与限制性基质甘油残留浓度的关系符合Monod关系式,细胞最大生长比速率为0.204h^-1,饱和常数为24.3g/L。经参数推导得理论最大细胞对甘油得率为0.497g/g,以及菌体生长维持系数为0.007g/g·h,后者说明此株工程菌有高密度发酵的潜力。诱导阶段补加酵母提取物、大豆蛋白胨和微量元素能有效提高目的蛋白产量。在发酵罐上罐试验中,目的蛋白产量达256mg/L,蛋白产量是摇瓶发酵蛋白产量的5倍多。     

朱黄青霉α-葡聚糖酶在毕赤酵母中的高效表达

【目的】提高朱黄青霉（Penicillium minioluteum ）α-葡聚糖酶（Dextranase）基因在毕赤酵母（Pichia pastoris）中的表达水平。【方法】根据毕赤酵母的密码子偏爱对酶基因进行优化与合成。优化后的基因片段与载体 pGAPZαA 连接,转化毕赤酵母 KM71 H。【结果】获得组成型分泌表达α-葡聚糖酶的工程菌 KM71 H／pGAPZαA-dex。发酵工艺试验中,摇瓶培养144 h,酶活为153 U／mL。6．8 L发酵罐补料分批培养92 h,酶活达到1218 U／mL。【结论】该工程菌以甘油作为碳源,发酵调控简单,产酶水平较高,具有适用于大规模生产的潜力。     

人白血病仰制因子基因在酵母中的融合表达

用ＰＣＲ突变的方法使人白血病抑制因子基因的终止密码子缺失，并与质粒ｐＰＩＣＺαＡ上的ｍｙｃ表位及６个组氨酸处于同一读码框，构建融合表达载体ｐＰＩＣＺαＡ－ｈＬＩＦＭ．通过氯化理化学转化法使表达载体整合到毕赤巴斯德酵母Ｘ－３３的基因组ＤＮＡ中。转化子经甘油增菌和甲醇诱导，实现了ｈＬＩＦ基因在毕赤酵母表达载体系统中的表达．ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测和 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析结果表明在相对分子质量为６１ ０００处有一条人白血病抑制因子特异蛋白带．凝胶薄层扫描分析结果显示表达的目的蛋白占培养液上清总蛋白的 ３３．３％．且该表达产物具有抑制小鼠畸胎瘤细胞Ｆ９克隆形成的活性．     

Pichia pastoris表达系统提高表达量的几个关键点

Pichia pastoris是近年来迅速发展的一种真核生物表达宿主，有着广阔的应用前景．本文从提高Ppastoris表达重组蛋白产量的角度，就启动子、高拷贝重组子、密码子偏爱、宿主菌和高密度发酵等方面的优化进行了综述．     

Expression and Characterization of HGV E2 cDNA in Pichia pastoris

A 559 base pair fragment of cDNA locating at the putative E2 region of GBV-C/HGV was in-serted into Pichia pastoris expression vector pPICgK in the reading frame of α-factor secreting signal pep-tide. The recombinant expression plasmid pPIC9K-E2 was introduced into P. pastoris GSll5 with electro-poration and recombined with the host genome by homological recombination. The His+Mut+ recombinantyeasts were selected and cultivated in the BMMY medium. After 3 days induction with 0. 5% methanol,the target protein(E2) accumulated up to 30% of total proteins in the supernatant. The expressed E2 pro-tein was proved possessing antigenicity and high specificity with Western blot and ELISA probed with serafrom the immunized rabbits and the patients infected by GBV-C/HGV.     

优选发酵毕赤酵母与酿酒酵母混合发酵的葡萄酒酿造应用潜力

实验基于主要发酵副产物的生成含量评价优选发酵毕赤酵母与酿酒酵母混合发酵对葡萄酒质量的影响。采用优选发酵毕赤酵母Z9Y-3和商业酿酒酵母F33设计同时和顺序两种接种方式启动模拟葡萄汁的酒精发酵,以酿酒酵母和发酵毕赤酵母单菌株发酵为对照。琥珀酸和乳酸利用高效液相色谱法测定,甘油采用高碘酸钠氧化法分析,挥发酸采用水蒸气蒸馏法测定。结果显示,优选菌株参与下的发酵没有显著影响酒精发酵的进程,但在发酵过程中发酵毕赤酵母生长速率低于酿酒酵母。与酿酒酵母纯发酵相比,混合发酵提高了甘油的含量,降低了挥发酸的含量,其中顺序接种的发酵过程中酿酒酵母活菌数最高,发酵毕赤酵母存活期最长(7d),发酵过程中甘油累积量最高(2.7g/L),挥发酸含量最低(0.2g/L)。不同发酵处理中,琥珀酸和乳酸含量均呈现先增后降的趋势,但其最终含量变化不显著。综上可得,优选发酵毕赤酵母和酿酒酵母的混合发酵具有应用于葡萄酒酿造的应用潜力。     

兔IL-15蛋白在毕赤酵母中的表达及其免疫学活性

用特异性引物扩增出兔IL-15基因片段,用KpnI和NotI双酶切后将其定向克隆到pPICZαA中,构建出重组质粒pPICZαAIL-15。将pPICZαAIL-15用SacI内切酶线性化后,电转化感受态GS115酵母细胞,用PCR法筛选阳性重组子。用1.5%的甲醇诱导重组酵母菌,取培养物上清进行重组蛋白的检测。结果SDS-PAGE电泳可在重组酵母菌培养物上清中检测到分子量为18.6kDa大小的重组蛋白。凝胶薄层扫描分析表明,3株重组酵母菌在1.5%甲醇诱导144h后,重组IL-15表达量约占培养物上清总蛋白量的6.1%~8.6%。将重组IL-15用Ni离子亲和层析纯化后,在MTT试验中表现出明显的促进淋巴细胞的增殖反应,证实表达的重组IL-15具有天然蛋白的免疫学活性。     

毕赤酵母表达硒代重组人血清白蛋白的研究

本试验将能够成功表达重组人血清白蛋白(rHSA)的巴斯德毕赤酵母培养至诱导期后，流加亚硒酸钠，同时设空白对照发酵液(不加入亚硒酸钠)，通过对比相同菌株在两组培养基中表达的rHSA的含硒量，判断硒能否以硒代氨基酸的形式存在于重组蛋白质中。发酵液经热处理、超滤、离子交换和丙酮沉淀等步骤后，进行Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳、X射线能量色散谱(EDX)和原子吸收分析。结果表明，加硒发酵液样品中硒元素的质量分数比对照多23.2%，硒与蛋白质的质量比为0.0069，高于对照发酵液近35倍，初步证明无机硒可以被毕赤酵母同化，转化为硒代氨基酸，并形成硒代重组蛋白质。     

β葡聚糖酶杂合基因bglHAM的克隆及在P.pastoris中的表达

采用PCR的方法,以Bacillus macerans总DNA为模板,构建出β-1,3-1,4葡聚糖酶杂合基因bglHAM,与巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9K重组,得到重组质粒pPIC9K-HAM,电脉冲转化法转化酵母菌GS115,KM71,在MM,MD平板上筛选表型,YPD-G418平板上筛选多拷贝重组子,重组菌株经甲醇诱导后,刚果红平板染色法检测到β-葡聚糖酶活性,SDS-PAGE证明表达产物的分子量约为24kD,摇瓶诱导培养筛选到的重组菌株,胞外每mL发酵液最高酶活达240U。